飞净 Phygene 质粒大提试剂盒 Plasmid Maxi Preparation Kit

产品简介
本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA 的原理特异性提取质粒DNA。  离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附 DNA，可较大限度去除杂质蛋白及细胞中其他**化合物，一般从 50-100ml 大肠杆菌 LB 培养液中，可快速提取 200-300μg 高纯度高拷贝的质粒DNA，提取率达 85-90%。  使用本试剂盒提取的质粒 DNA 可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。

使用前请先在漂洗液中加入无水，加入体积请参照瓶体上的标签。溶液Ⅰ在使用前先加入 RNaseA（将试剂盒中提供的 RNaseA 全部加入） ，混匀，置于 2-8℃保存。如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 

操作步骤
1.  收集 50-100ml 过夜培养的菌液 11000rpm离心10分钟，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

2.  向留有菌体沉淀的离心管中加入 5ml 溶液Ⅰ (请先检查是否已加入 RNaseA)  ，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。

3.  向离心管中加入 5ml 溶液Ⅱ  ，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。  注意：①翻转一定要温和，以免污染细菌基因组 DNA。②作用时间不要**过 5 分钟，以免质粒受到破坏。

4.  向离心管中加入 7ml 溶液Ⅲ  ，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀(如菌液过多，可在此步放置 5 分钟，以尽可能的降解 RNA)。11000rpm 离心 10 分钟，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，注意尽量不要吸出沉淀。

注意：溶液Ⅲ加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。  如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 

5.  将上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温放置 2-3 分钟，11000rpm 离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中(如为提高得率，可将收集管中的液体加入吸附柱再次吸附一次)。

6.  向吸附柱中加入 8ml 漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水)，11000rpm 离心 2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

7.  向吸附柱中加入 6ml 漂洗液，11000rpm离心 2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

8. 11000rpm离心 5min，将吸附柱敞口置于室温或 50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的会影晌后续的实验如酶切、PCR 等。

9.  将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜*悬空滴加1-2ml经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，11000rpm离心 2min，收集质粒溶液用于后续实验。

10.  为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置 5min， 11000rpm离心 2min。

注意事项
1、溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA(将试剂盒中提供的RNaseA 全部加入)，混匀，置于2-8℃保存。

2、**次使用前应按照试剂瓶标签的说明在漂洗液中加入无水乙 醇配制成工作液(向15ml的漂洗液中加入60ml的无水。

3、使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊，如有混浊现象 可在37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。

4、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用后应立即盖紧盖子，如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心。

5、如果是提取革兰氏阳性菌质粒，必须在裂解细胞前破细胞壁，方法如下：收集适量菌体，加入5ml溶液Ⅰ，充分悬浮菌体，加入溶菌酶至终浓度为10-20mg/ml，37℃处理30min左右。加入溶菌酶的浓度和处理时间可根据不同的菌株和具体试验条件进行调整。还可以选择D1120、D1130革兰氏阳性菌质粒提取试剂盒。

6. 洗脱缓冲液体积不应少于500ul，体积过小影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影晌，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)， pH值低于7. 0会降低洗脱效率。 DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

7. 如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用400-800ml过夜培养物，同时按照比例增加溶液Ⅰ 、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。

8. DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。 得到的DNA可用琼脂糖疑胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。 DNA应在OD260处有显着吸收峰，OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA、 40μg/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响吸光值，但并不表示纯度低。

*Important Note: This product as supplied is intended for research use only, not for use in human, therapeutic or diagnostic applications.
我们所提供的产品仅供科研使用，不得用于临床诊断、**、食品或者化妆品等用途！